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Nancent蛋白質(zhì)合成分析

更新時(shí)間:2022-11-04      點(diǎn)擊次數(shù):1424

HPG/AHA蛋白合成分析方案熒光顯微鏡


介紹


L-高炔丙基甘氨酸(HPG)和L-疊氮高丙氨酸(AHA)是傳統(tǒng)35S蛋氨酸的非放射性替代品,后者在活性蛋白質(zhì)合成過程中被并入蛋白質(zhì)中,可以直接添加到細(xì)胞中。用于檢測從頭合成蛋白的基于HPG和AHA的商業(yè)試劑盒提供了很好的結(jié)果,但通常非常昂貴,并且提供了固定量的試劑,這限制了這些試劑盒的優(yōu)化或非協(xié)議使用。自組裝套件是商用套件的可行替代品,尤其是當(dāng)所有組件都可從許多供應(yīng)商處廣泛獲得時(shí)。試劑的量和點(diǎn)擊反應(yīng)條件在許多商業(yè)試劑盒之間非常相似,并且符合大量已發(fā)表的基于HPG和AHA的新合成蛋白質(zhì)檢測程序。使用所提供的方案,研究人員將能夠組裝HPG或AHA蛋白質(zhì)合成測定,這將需要很少的微調(diào)(如果有的話)。




這些具有改進(jìn)的生物相容性和檢測極限的試劑盒首先由賽默飛世爾科學(xué)公司商業(yè)化,并以Click iT®HPG和Click i T®AHA的價(jià)格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代銅螯合疊氮化物。在疊氮化物報(bào)告分子處引入銅螯合部分允許顯著增加反應(yīng)位點(diǎn)處的有效Cu(I)濃度,增強(qiáng)了反應(yīng)速率加速中的最弱環(huán)節(jié),大大提高了用于分析細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的基于HPG和AHA的測定的靈敏度和生物相容性。




所需材料


HPG(L-炔丙基甘氨酸)或AHA(L-氮雜高丙氨酸)


AZDye吡啶疊氮化物


五水合硫酸銅(II)


THPTA公司


抗壞血酸鈉


固定劑(PBS中3.7%甲醛)


滲透試劑(例如,0.5%Triton®X-100 PBS溶液)


PBS中的3%BSA(pH 7.4)


Hoechst 33342(可選)


材料準(zhǔn)備


HPG/AHA儲(chǔ)備溶液制備50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液,例如使1 mL 50 mM儲(chǔ)備溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中


AZDye Picolyl Azide儲(chǔ)備溶液在DMSO或水中制備1mM溶液。示例:要制備150µL,將整個(gè)AZDye Picolyl Azide試劑盒溶于150µL DMSO或水中


銅催化劑(25 mM CuSO4,62.5 mM THPTA)溶液稱出312 mg五水合硫酸銅(II)和1.35 g THPTA,加入50 mL水,渦旋至溶解


反應(yīng)緩沖液50 mM Tris,150 mM NaCl,pH 7.5。將3.02 g Tris,4.4 g NaCl溶于500 mL水中,調(diào)節(jié)pH至7.5,無菌過濾器


Hoechst 33342 10 mg/mL儲(chǔ)備溶液。將1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去離子水中


還原劑將20 mg抗壞血酸鈉溶于1.8 mL去離子水中。渦旋直至溶解??箟难徕c溶液易被氧化。我們建議始終使用新鮮制備的抗壞血酸鈉溶液


在PBS中洗滌緩沖液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g干燥die氮化鈉。用于長期儲(chǔ)存的無菌過濾器


1.用HPG/AHA標(biāo)記細(xì)胞


該方案基于大量基于HPG和AHA的程序的出版物,用于分析與不同類型細(xì)胞一起使用的細(xì)胞中的肽合成。優(yōu)化的HPG/AHA濃度為50μM,但可能需要根據(jù)給定的細(xì)胞類型進(jìn)行調(diào)整。生長培養(yǎng)基、細(xì)胞密度、細(xì)胞類型變化和其他因素可能會(huì)影響標(biāo)記。鼓勵(lì)研究人員首先確定HPG試劑的最佳濃度以及每種細(xì)胞類型的標(biāo)記時(shí)間。




將細(xì)胞以所需的密度放置在蓋玻片上,并在額外處理前讓其恢復(fù)過夜


在DMSO或水中制備50 mM HPG或AHA溶液


用PBS清洗細(xì)胞一次,加入無蛋氨酸培養(yǎng)基,并在37°C下孵育細(xì)胞30–60分鐘,以耗盡蛋氨酸儲(chǔ)備


將所需量的HPG或AHA添加到無L-蛋氨酸培養(yǎng)基中的細(xì)胞中,以達(dá)到最佳工作HPG/AHA濃度(50μM,如果未優(yōu)化)


在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入HPG或AHA時(shí),避免以可能破壞正常細(xì)胞循環(huán)模式的方式干擾細(xì)胞


在適合細(xì)胞類型的條件下培養(yǎng)細(xì)胞所需的時(shí)間。不同的細(xì)胞類型可能需要不同的孵育期,以便用HPG或AHA進(jìn)行最佳標(biāo)記。作為起點(diǎn),我們建議50μM HPG或AHA持續(xù)1小時(shí)


立即進(jìn)行細(xì)胞固定和滲透


2.細(xì)胞固定和滲透

以下方案用于在PBS中使用3.7%甲醛的固定步驟,然后進(jìn)行0.5%Triton®X-100滲透步驟。也可以使用使用其他固定/滲透試劑(如甲醇和皂苷)的方案。




將每個(gè)蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)井中。為了方便加工,使用6孔板


代謝標(biāo)記后,移除培養(yǎng)基,向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室溫下孵育15分鐘


去除固定劑,用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次


取出洗滌液。向每個(gè)孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液,然后在室溫下孵育20分鐘


3.HPG/AHA檢測


注:每個(gè)蓋玻片使用500μL反應(yīng)混合物。只要剩余的反應(yīng)組分保持在相同的比例,可以使用較小的體積。




根據(jù)表1制備所需量的反應(yīng)雞尾酒。按表中所列順序添加配料。在制備后15分鐘內(nèi)使用反應(yīng)混合物。




表1




image.png


移除滲透緩沖液(步驟2.4)。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(gè)孔中的細(xì)胞兩次。取出洗滌液。


向每個(gè)含有蓋玻片的孔中加入0.5mL反應(yīng)雞尾酒。短暫搖動(dòng)盤子,確保反應(yīng)混合物均勻分布在蓋玻片上。


避光,在室溫下孵育板30分鐘


取出反應(yīng)混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。


用1mL洗滌緩沖液洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。


用1mL PBS洗滌每個(gè)孔一次。取出洗滌液。


此時(shí),樣本已準(zhǔn)備好進(jìn)行DNA染色。如果不需要DNA染色,繼續(xù)進(jìn)行成像


如果需要對樣品進(jìn)行抗體標(biāo)記,請按照制造商的建議進(jìn)行標(biāo)記。培養(yǎng)過程中,保持樣品免受光照。


4.DNA染色


用1mL PBS清洗每個(gè)孔。取出洗滌液。


通過稀釋Hoechst 33342 1:2000的儲(chǔ)備溶液制備1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最終濃度為5µg/mL。


1x Hoechst 33342的最終濃度范圍為2μg/mL至10μg/mL。


每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光線照射。在室溫下孵育30分鐘。


移除Hoechst 33342溶液。


用1mL PBS洗滌每個(gè)孔兩次。


取出洗滌液。

成像


標(biāo)記細(xì)胞與所有載玻片制備方法兼容




所選引用:


Dieterich,D.C.、Link,A.J.、Graumann,J.、Tirrell,D.A.和Schuman,E.M.等人(2006)。使用生物正交非經(jīng)典氨基酸標(biāo)記(BONCAT)選擇性鑒定哺乳動(dòng)物細(xì)胞中新合成的蛋白質(zhì)。美國國家科學(xué)院院刊,103(25),9482-87。[PNAS]




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