1.簡(jiǎn)介

三（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來(lái)酰亞胺三fu乙酸鹽購(gòu)自 西格瑪-奧爾德里奇.聚合物水凝膠作為瞬時(shí)人工細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）替代品廣泛用于組織工程技術(shù)中，以提供機(jī)械支持、細(xì)胞粘附位點(diǎn)、細(xì)胞響應(yīng)重塑以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的運(yùn)輸[3-5]?；谔前肪厶牵℅AG）的聚合物網(wǎng)絡(luò)已成為一種特別強(qiáng)大的水凝膠變體，因?yàn)樗鼈冊(cè)试S細(xì)胞因子的仿生給藥以指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定[6]。為了利用由此產(chǎn)生的選擇，我們之前開(kāi)發(fā)了一種基于GAG的水凝膠的理論驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)概念，能夠獨(dú)立調(diào)節(jié)多個(gè)細(xì)胞指導(dǎo)性基質(zhì)線索[7]： 由多臂（星形）聚乙二醇（星形PEG）和GAG肝素形成的生物雜化水凝膠通過(guò)摻入基質(zhì)金屬蛋白酶敏感（MMP）肽進(jìn)行交聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞響應(yīng)性重塑和整合素結(jié)合RGD肽以控制細(xì)胞粘附[8-12]。改變星形PEG與肝素的摩爾比和反應(yīng)混合物的固體含量，為在水凝膠生物活性成分的固定濃度下調(diào)節(jié)交聯(lián)度和機(jī)械材料性能創(chuàng)造了選擇[7，12-14]。帶高度負(fù)電荷的GAG肝素與大量不同化學(xué)因子和生長(zhǎng)因子的非共價(jià)絡(luò)合物相吻合，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFa），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）， 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF1α）[10，15–23]。合理設(shè)計(jì)的星形PEG-GAG水凝膠可以使用不同的交聯(lián)反應(yīng)形成：GAG的羧酸基團(tuán)和胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過(guò)活性酯（碳化二亞胺）化學(xué)形成[13]。或者，馬來(lái)酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應(yīng)方案轉(zhuǎn)化[12]。后一種方法允許細(xì)胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù)。 GAG的羧酸基團(tuán)與胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過(guò)活性酯（碳化二亞胺）化學(xué)形成[13]?；蛘?，馬來(lái)酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應(yīng)方案轉(zhuǎn)化[12]。后一種方法允許細(xì)胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù)。 GAG的羧酸基團(tuán)與胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過(guò)活性酯（碳化二亞胺）化學(xué)形成[13]?；蛘?，馬來(lái)酰亞胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯(lián)物使用邁克爾型加成反應(yīng)方案轉(zhuǎn)化[12]。后一種方法允許細(xì)胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用于微創(chuàng)植入技術(shù)。

雖然以前的體內(nèi)研究一直在探索星形PEG-GAG水凝膠的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括祖細(xì)胞在缺血組織中的積累[10]，慢性皮膚傷口的抗炎治療和愈合[24，25]以及帕金森病的新細(xì)胞移植策略[20]，但他們主要關(guān)注材料的細(xì)胞指導(dǎo)特性，沒(méi)有研究宿主對(duì)植入物的反應(yīng)。植入后，所有生物材料都會(huì)不同程度地誘導(dǎo)異物反應(yīng)，并消除它們與宿主組織的相互作用[26]。 據(jù)報(bào)道，降解和細(xì)胞浸潤(rùn)速率（作為組織重建的第一階段）以及材料的動(dòng)態(tài)變化物理性質(zhì)及其呈現(xiàn)可溶性介質(zhì)分子（特別是生長(zhǎng)因子）的能力決定了植入物的命運(yùn)[28]。皮下注射時(shí)，不含GAG成分的純PEG水凝膠可誘發(fā)顯著炎癥反應(yīng)，摻入RGD細(xì)胞粘附配體可部分減弱炎癥反應(yīng)[29，30]。此外，PEG水凝膠已加載各種類(lèi)型的生長(zhǎng)因子，以促進(jìn)所需的促再生過(guò)程，例如血管形成（VEG Fa）[31]或骨修復(fù)（骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2））[27]。然而 到目前為止，還沒(méi)有研究評(píng)估原位組裝星形PEG-GAG水凝膠的異物反應(yīng)，由于摻入的GAG單元作為高親和力結(jié)合位點(diǎn)，可持續(xù)地提供生長(zhǎng)因子，并允許獨(dú)立調(diào)整物理網(wǎng)絡(luò)特性，粘附性和細(xì)胞響應(yīng)重塑。作為細(xì)胞外基質(zhì)的組成部分，GAG在活組織中實(shí)現(xiàn)許多不同的功能。它們創(chuàng)建信號(hào)介質(zhì)庫(kù)并調(diào)節(jié)其功能，在胚胎發(fā)生和發(fā)育[32，33]，體內(nèi)平衡[34]，炎癥[35]，腫瘤形成和進(jìn)展[36]中發(fā)揮多方面作用。提到基于GAG的細(xì)胞指導(dǎo)材料的重要性， 本研究旨在系統(tǒng)地評(píng)估宿主對(duì)具有不同物理和粘附特性、生物降解特性和促血管生成生長(zhǎng)因子功能化的模塊化原位形成starPEG-GAG水凝膠的反應(yīng)模式。選擇野生型免疫功能正常小鼠（C57BL/6J）皮下植入作為代表性模型[37-40]。對(duì)皮下植入材料的免疫和血管生成反應(yīng)通過(guò)組織學(xué)確定，包括H&E，CD31和CD68染色。通過(guò)評(píng)估材料的細(xì)胞浸潤(rùn)和鄰近組織的血管化來(lái)評(píng)估靶組織中水凝膠的整合。報(bào)告數(shù)據(jù)證明了優(yōu)異的組織相容性， 建議使用可調(diào)原位組裝星形PEG-GAG水凝膠，用于安全有效的體內(nèi)組織工程應(yīng)用。

2.材料和方法

2.1.半胱氨酸封端PEG-（MMP）的合成與純化4

如前所述，合成了PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）[12]。簡(jiǎn)而言之，在肽合成器（Activo P14，Activotec）上采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相法合成了MMP可切割的Ac-GGPQGIWGQG-GCG-NH2（MMP）肽，并通過(guò)分析HPLC色譜法（1100系列;安捷倫科技）和 MALDI 質(zhì)譜（布魯克達(dá)爾托尼克有限公司）。接下來(lái)，將500mg四臂馬來(lái)酰亞胺封端的PEG-（馬來(lái)酰亞胺）4（MW 10000）溶解在5ml水中，并與溶解在5ml水中的350mgMMP肽（過(guò)量5%）混合。接著，加入5ml磷酸鹽緩沖液pH 7.4。通過(guò)加入1M NaOH將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至pH 7.5–8。反應(yīng)在N2氣氛下運(yùn)行5 h，反應(yīng)完成后進(jìn)行HPLC。 為了去除StBu保護(hù)基團(tuán)，將摩爾過(guò)量（肽）TCEP溶液（pH 7-8）加入反應(yīng)混合物中，并在室溫下攪拌數(shù)小時(shí)。接下來(lái)，將反應(yīng)混合物蒸發(fā)，溶于水中，并通過(guò)制備型HPLC純化。從HPLC收集產(chǎn)物，與0.1ml 1M HCl混合并冷凍干燥至少24小時(shí)。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲(chǔ)存在-20°C。1毫升1M HCl并冷凍干燥至少24小時(shí)。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲(chǔ)存在-20°C。1毫升1M HCl并冷凍干燥至少24小時(shí)。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯(lián)物（PEG-（MMP）4）儲(chǔ)存在-20°C。

2.2.肝素-馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物的合成純化

所有肝素馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物均如前所述合成[12，41]。簡(jiǎn)而言之，將三倍摩爾過(guò)量的EDC和1.5倍摩爾過(guò)量的sNHS（指馬來(lái)酰亞胺）加入溶解在3ml超純水中的0.5g肝素溶液中。將反應(yīng)混合物在4°C下保持20分鐘。接著，將溶解在超純水中（4°C）中的N-（2-氨基乙基）馬來(lái)酰亞胺三fu乙酸鹽加入到反應(yīng)混合物中并在室溫下攪拌過(guò)夜。通過(guò)透析（分子量截止值為8kDa的膜）對(duì)1 l的1 M氯化鈉純化3次偶聯(lián)物，然后用1 l水透析5次，以除去任何未反應(yīng)的馬來(lái)酰亞胺。然后將產(chǎn)物冷凍干燥至少24小時(shí)并儲(chǔ)存在-20°C。 形成的偶聯(lián)物的純度和反應(yīng)性由HPSEC（1100系列;安捷倫科技公司）。
用于肽合成的所有溶劑和試劑均購(gòu)自IRIS Biotech GmbH.Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來(lái)酰亞胺三fu乙酸鹽購(gòu)自Sigma-Aldrich。四臂馬來(lái)酰亞胺封端聚乙二醇（Mn=10.0×103;PDI = 1.06）購(gòu)自JenKem Technology USA Inc.所有試劑均按原樣使用，未經(jīng)初步純化。

2.3.水凝膠制備

如前所述制備水凝膠[9]。凝膠制備與體內(nèi)植入在同一天進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將10mg肝素 - 馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)物（MW 15000）溶解在107μl磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（生物色素）中。將肝素溶液在冰上冷卻，并以3mM的終濃度加入0.79mg cRGD（國(guó)際肽）中。肝素-RGD溶液與小鼠重組生長(zhǎng)因子（VEG Fa，F(xiàn)GF2或SDF1α;培普羅科技）。每個(gè)植入物的最終生長(zhǎng)因子量是變化的，如表1所示。10mg的PEG-MMP偶聯(lián)物（MW 15920）或PEG（MW 15000），溶解在372μlPBS中。肝素-RGD溶液與PEG或PEG-MMP偶聯(lián)液以1∶1的比例輕輕混合， 并將30μl溶液迅速夾在兩個(gè)涂有Sigmacote（Sigma-Aldrich）的5mm玻璃蓋玻片之間。凝膠在室溫下在一分鐘內(nèi)形成。交聯(lián)后，除去蓋玻片，留下圓盤(pán)狀水凝膠。將每個(gè)凝膠盤(pán)立即浸入400μlPBS中以防止脫水，并儲(chǔ)存在4°C直至植入。

2.4.流變學(xué)

通過(guò)在裝有25 mm平行板幾何形狀的旋轉(zhuǎn)流變儀（Ares LN2，TA儀器）上進(jìn)行的膨脹凝膠盤(pán)上的振蕩測(cè)量來(lái)確定水凝膠的存儲(chǔ)模量。頻率掃描在25 °C下進(jìn)行，剪切頻率范圍為100-102 rad/s，應(yīng)變幅度為2%。儲(chǔ)能模量和損耗模量均作為剪切頻率的函數(shù)進(jìn)行測(cè)量。由于水凝膠的彈性，損耗模量比儲(chǔ)能模量低幾個(gè)數(shù)量級(jí)，并且低于流變儀的測(cè)量極限。存儲(chǔ)模量的平均值是通過(guò)至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算的，每個(gè)實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)技術(shù)重復(fù)。為了評(píng)估膠原酶降解對(duì)儲(chǔ)能模量的影響， 在4°C下形成水凝膠，加入1U / mlIV型膠原酶（生物色素），以1Hz掃描，直到?jīng)]有進(jìn)一步增加的剛度。然后將溫度升高至37°C以激活膠原酶，并繼續(xù)1Hz掃描直至植入物降解。

2.5.動(dòng)物和外科手術(shù)

所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)程序均由薩克森州區(qū)域辦事處（Landesdirektion Sachsen）動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)以及德累斯頓工業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（24-9168.11-6/2012-1）批準(zhǔn)。將C57BL / 6 J OlaHsd菌株（Harlan Laboratories GmbH）的12周齡雄性小鼠飼養(yǎng)在單通風(fēng)籠中（每籠3-4只小鼠）。
在手術(shù)前，通過(guò)腹膜內(nèi)注射lv胺酮100mg / kg和甲苯噻嗪10mg / kg對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重和麻醉。將動(dòng)物的背部剃光并用乙醇消毒。通過(guò)將水凝膠盤(pán)插入皮下的小口袋中并用縫合線閉合皮膚來(lái)皮下植入。植入硅盤(pán)（硅橡膠MDX4-4210生物醫(yī)用級(jí)彈性體，道康寧）作為對(duì)照。每只小鼠在背部的右側(cè)和左側(cè)獲得兩個(gè)植入物。兩種植入物中的一種含有生長(zhǎng)因子。實(shí)驗(yàn)裝置包括每個(gè)條件八只小鼠，盡管并非所有水凝膠支架都可以在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取回。監(jiān)測(cè)所有小鼠，直到它們從麻醉中恢復(fù)。在 7 天或 28 天時(shí)， 小鼠通過(guò)CO2窒息和頸椎脫位死亡。將植入物和全層真皮組織的相鄰區(qū)域一起切除，并立即固定在10%緩沖的福爾馬林（Fisher Scientific）中以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.6.組織學(xué)

對(duì)固定的組織樣品進(jìn)行自動(dòng)化組織處理，包括在乙醇和二甲苯溶液中逐漸脫水。之后，將樣品嵌入石蠟塊（Paraplast Plus）中，并使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切割矢狀切片，包括相鄰的修復(fù)組織，并使用親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）技術(shù)和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物試劑用CD31和CD68抗體染色。此外，所有切片均用蘇木精-伊紅（H&E）染色（細(xì)胞核-藍(lán)色;細(xì)胞質(zhì)，彈性蛋白和膠原粉紅色）染色。使用自動(dòng)玻片掃描儀Axio Scan.Z1和Plan-Aurochromat 20×/0.8 M27（蔡司）觀察和拍攝染色切片。

2.7.圖像分析

使用ImageJ分析圖像。根據(jù)表2，從盲圖像1到5對(duì)水凝膠的降解進(jìn)行評(píng)分。通過(guò)反復(fù)測(cè)量與植入物相鄰處形成的囊的寬度來(lái)評(píng)估異物反應(yīng)。對(duì)血管生成的影響被量化為重塑水凝膠內(nèi)肉瘤下方組織或直接相鄰組織中可見(jiàn)的CD31陽(yáng)性血管。

2.8.統(tǒng)計(jì)分析

在所有體外實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了來(lái)自每個(gè)水凝膠的至少三個(gè)樣品。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行，如果沒(méi)有其他描述。任何小于 0.05 的 P 值都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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