研究最終取決于群體的表達(dá)產(chǎn)物。無論是用于檢測(cè)還是用于棉花保護(hù)，表達(dá)的蛋白都需要分離純化。但蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所以方法也不同。

蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)決定了其物理、化學(xué)、生化、物理、化學(xué)、生物性質(zhì)。此外，它總結(jié)了不同蛋白質(zhì)性質(zhì)的差異或改變條件使它們不同。同時(shí)利用多種性質(zhì)，在兼顧產(chǎn)量和純度的情況下，選擇蛋白質(zhì)純化的方法。

蛋白質(zhì)一般以復(fù)雜混合物的形式存在于組織或細(xì)胞中，每種細(xì)胞毒性都包含數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和純化是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。蛋白質(zhì)純化的總體目標(biāo)是力圖提高產(chǎn)物的純度或比活性，要求純化合理、快速、得率高、純度高。并將蛋白質(zhì)從細(xì)胞中的其他所有成分中分離出來，特別是不需要的不純蛋白質(zhì)，同時(shí)仍然保留肽的生物活性和化學(xué)完整性。

之所以能從數(shù)千種蛋白質(zhì)混合物中純化出一種蛋白質(zhì)，是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)具有截然不同的物理、化學(xué)、理化和生物特性。

這些性質(zhì)是由蛋白質(zhì)的氨基酸序列和數(shù)量不同造成的，連接在多肽主鏈上的氨基酸殘基是帶正電的、帶電的、極性的還是非極性的、親水的還是疏水的。

此外，多肽還可以折疊成非常確定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊和各種角度）、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。利用待分離蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)性質(zhì)的差異，在蛋白質(zhì)表面形成一定大小、形狀和分布的殘基，并設(shè)計(jì)一套合理的分級(jí)分離步驟。

蛋白質(zhì)混合物可以根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)對(duì)應(yīng)的方法進(jìn)行分離：

1 分子大小

不同類型的蛋白質(zhì)在分子大小上有一定的差異，可以采用一些簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。

1.1 透析和超濾

透析在純化中非常常用，可以去除鹽（脫鹽和置換緩沖液）、有機(jī)溶劑和低分子量抑制劑。透析膜的截留分子量約為5000。例如，分子量小于10000的酶溶液可能會(huì)泄漏。超濾一般用于濃縮和脫色。

1.2 更換緩沖液的離心分離

許多酶富含于某種細(xì)胞器中。勻漿后，通過離心得到某種亞細(xì)胞成分，使酶富集10-20倍，然后純化出特定的酶。差速離心，分辨率低，僅適用于粗提取或濃縮。

速率分區(qū)，如果離心時(shí)間太長(zhǎng)，所有物質(zhì)都會(huì)沉淀。因此，需要選擇最佳的分離時(shí)間，以獲得相當(dāng)純的亞細(xì)胞成分進(jìn)行進(jìn)一步純化，避免差速離心中大、小成分的沉淀。但容量較小，只能少量使用。

密度梯度離心常用的介質(zhì)包括蔗糖、聚蔗糖、氯化銫、溴化鉀和碘化鈉。

1.3 凝膠過濾

這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的有效方法之一。注意待分離蛋白質(zhì)的分子量在凝膠的工作范圍內(nèi)。選擇不同分子量的凝膠可用于脫鹽、更換緩沖液以及利用分子量差異去除熱源。

2 形狀

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在離心過程中穿過溶液時(shí)，或者當(dāng)它們穿過膜、凝膠過濾填料顆粒或電泳凝膠中的小孔時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)受到其形狀的影響。

對(duì)于相同質(zhì)量的兩種蛋白質(zhì)，環(huán)狀蛋白質(zhì)的有效半徑（斯托克斯半徑）較小。通過溶液沉降時(shí)遇到的摩擦力很小，沉降速度更快，并且比其他形狀的蛋白質(zhì)顯得更大。相反，在尺寸排阻色譜中，斯托克半徑較小的球狀蛋白質(zhì)更容易擴(kuò)散到凝膠過濾填料顆粒內(nèi)部并隨后洗脫，因此它們看起來比其他形狀的蛋白質(zhì)更小。

3 溶解度

利用蛋白質(zhì)溶解度的差異來區(qū)分各種蛋白質(zhì)的常用方法。影響蛋白質(zhì)溶解度的外界因素有很多，其中主要的有：溶液pH、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度。但在相同的特定外部條件下，不同的蛋白質(zhì)具有不同的溶解度。適當(dāng)改變外部條件來控制蛋白質(zhì)混合物中某種成分的溶解度。

3.1 pH控制和等電點(diǎn)沉淀

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)通常溶解度較低。

3.2 蛋白質(zhì)的鹽腌和鹽析

3.3 有機(jī)溶劑分類方法

蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解度差異很大，從基本不溶（<10μg/ml）到極易溶解（>300mg/ml）。影響蛋白質(zhì)溶解度的可變因素包括溫度、pH、溶劑極性、離子性質(zhì)和離子強(qiáng)度。引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此可以控制有機(jī)溶劑的濃度來分離蛋白質(zhì)。

水溶性非離子聚合物（聚乙二醇）也會(huì)引起蛋白質(zhì)沉淀。

3.4 溫度

不同的蛋白質(zhì)在不同的溫度下具有不同的溶解度和活性。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此分離操作一般在0℃或更低的溫度下進(jìn)行。

4 充電

蛋白質(zhì)的凈電荷取決于氨基酸殘基攜帶的正電荷和負(fù)電荷的總和。例如，帶有凈負(fù)電荷的中性溶液稱為酸性蛋白質(zhì)。

4.1 電泳

它不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要方法，也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)的非常有用的方法。

等電聚焦分辨率非常高，pI可以以0.02pH的差異分離。

蛋白質(zhì) 2D-PAGE 分離的分辨率已發(fā)展到 100,000 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

4.2 離子交換色譜法

改變蛋白質(zhì)混合溶液中的鹽離子強(qiáng)度pH和(陰離子、陽(yáng)離子)離子交換填料，不同蛋白質(zhì)對(duì)不同離子交換填料的吸附能力不同，蛋白質(zhì)因吸附能力不同或不被吸附而分離。

可以通過保持洗脫液組成恒定或通過改變洗脫液的鹽度或pH來進(jìn)行洗脫。后者又可分為分段洗脫和梯度洗脫。梯度洗脫一般效果好，分辨率高，特別是使用交換容量小、對(duì)鹽濃度敏感的離子交換劑?？刂葡疵撘旱捏w積（與柱床的體積相比）、鹽濃度和pH，以及樣品組分可以從離子交換柱中單獨(dú)洗脫。

蛋白質(zhì)分子外表面暴露的側(cè)鏈基團(tuán)的類型和數(shù)量不同，因此緩沖液在一定pH值和離子強(qiáng)度下的電荷也不同。

5 電荷分布

帶電的氨基酸殘基可以均勻分布在蛋白質(zhì)表面，可以與適當(dāng)強(qiáng)度的陽(yáng)離子交換柱或與陰離子結(jié)合。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)不能在單一溶劑中與兩種類型的離子交換柱結(jié)合，因此可以利用這種特性來純化它們。帶電的氨基酸殘基還可以成簇分布，使得一個(gè)區(qū)域帶強(qiáng)正電荷，另一區(qū)域帶強(qiáng)負(fù)電荷，呈強(qiáng)酸性或強(qiáng)酸性。可與陽(yáng)離子交換樹脂或一定pH條件下的陽(yáng)離子交換樹脂結(jié)合使用。例如，鈣調(diào)蛋白只能在 pH 2 時(shí)與陽(yáng)離子交換樹脂結(jié)合。

6 疏水性

大多數(shù)疏水性氨基酸殘基隱藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部，但也有一些位于表面。蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基的數(shù)量和空間分布決定了蛋白質(zhì)是否具有與疏水性柱填料結(jié)合用于分離的能力。

其價(jià)格低廉，純化的蛋白質(zhì)具有生物活性，是分離純化蛋白質(zhì)的通用工具。

高濃度鹽水溶液中的蛋白質(zhì)保留在柱上，并在低鹽或水溶液中從柱上洗脫。因此，特別適合濃硫酸銨溶液沉淀分離后的母液，以及沉淀后含有目標(biāo)產(chǎn)物的溶液用鹽溶解后直接注入柱中。

7mol/鹽酸胍或8mol/L尿素也適用于直接注入柱中的大腸桿菌蛋白提取物的處理，并且在復(fù)性的同時(shí)進(jìn)行分離。

7 密度

大多數(shù)蛋白質(zhì)的密度在1.3~1.4g/cm3之間。該特性通常不常用于蛋白質(zhì)分級(jí)分離。

但含有大量磷酸鹽或脂質(zhì)的蛋白質(zhì)的密度與普通蛋白質(zhì)明顯不同，因此大多數(shù)蛋白質(zhì)可以通過密度梯度離心分離。

8 基因工程構(gòu)建的純化標(biāo)記

通過改變cDNA，在表達(dá)蛋白的氨基端或羧基端添加少量額外的氨基酸，可以作為純化的有效基礎(chǔ)。

8.1 GST融合向量

待表達(dá)的蛋白與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后用谷胱甘肽Sepharose 4B純化，然后用凝血酶或因子Xa切割。

8.2 蛋白A融合載體

將待表達(dá)的蛋白與蛋白 A 的 IgG 結(jié)合位點(diǎn)融合在一起進(jìn)行表達(dá)，并用 IgG Sepharose 進(jìn)行純化。

8.3（組氨酸標(biāo)記）螯合瓊脂糖凝膠

最常見的標(biāo)記之一是在蛋白質(zhì)的氨基末端添加6~10個(gè)組氨酸。在正?；蜃冃詶l件下（8M尿素），借助其與Ni2+螯合柱緊密結(jié)合的能力，用咪唑洗滌去除或?qū)H降至5.9，使組氨酸全質(zhì)子化，不再與Ni2+結(jié)合，使其純化。

重組蛋白在設(shè)計(jì)和構(gòu)建時(shí)已融入純化概念。樣品中大多混有破碎細(xì)胞或可溶產(chǎn)物。膨脹床吸附技術(shù) STREAmLINE 適用于粗分離。

9 親和力

兼具效率高、分離速度快的特點(diǎn)。配體可以是酶底物、抑制劑、輔因子和特異性抗體。

吸附后，可以改變緩沖液的離子強(qiáng)度和pH值來洗脫目標(biāo)蛋白。也可用更高濃度的相同配體溶液或親和力更強(qiáng)的配體溶液進(jìn)行洗脫。

與超濾相結(jié)合，濃縮兩者的優(yōu)點(diǎn)，形成超濾親和純化，具有分離效率高、可大規(guī)模工業(yè)化的優(yōu)點(diǎn)，適合初步分離。

根據(jù)配體的不同，可分為：

(1)金屬螯合介質(zhì)

過渡金屬離子Cu2＋、Zn2＋、Ni 2＋ 以亞胺配合物的形式結(jié)合。由于這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸形成配位鍵，從而形成亞胺金屬-蛋白質(zhì)螯合物，使得含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)被該金屬螯合物親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩(wěn)定性由單個(gè)組氨酸和半胱氨酸的解離常數(shù)控制，該解離常數(shù)還受到流動(dòng)相的 pH 和溫度的影響?？刂茥l件可以將不同的蛋白質(zhì)彼此分離。

(2) 小配體親和介質(zhì)

配體包括精氨酸、苯甲酰胺、鈣調(diào)蛋白、明膠、肝素和賴氨酸。

(3) 抗體親和介質(zhì)

免疫親和層析，配體為重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G特異性更強(qiáng)，并且蛋白G可以結(jié)合更多不同來源的IgG。

(4)顏料親和介質(zhì)

染料色譜的效果主要取決于染料配體及其與酶的親和力大小。它還與洗脫緩沖液的類型、離子強(qiáng)度、pH值和待分離樣品的純度有關(guān)。有兩種配體：Cibacron Blue 和 Procion Red。在某些條件下，固定化染料可以充當(dāng)陽(yáng)離子交換劑。為了避免這種現(xiàn)象，最好在離子強(qiáng)度小于0.1、pH大于7時(shí)進(jìn)行操作。

(5) 外源凝集素親和介質(zhì)

配體包括刀豆球蛋白、扁豆凝集素和麥芽凝集素。固相凝集素可以與多種碳水化合物殘基發(fā)生可逆反應(yīng)，適用于多糖和糖蛋白的純化。

10 非極性群體之間的力量

流動(dòng)相中的置換劑是極性比水小的有機(jī)溶劑，這些有機(jī)溶劑可能會(huì)導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆的變性。流動(dòng)相中必須存在離子對(duì)試劑才能使分離有效并獲得高質(zhì)量回收率。分離必須在酸性介質(zhì)中進(jìn)行，而有些蛋白質(zhì)在后兩種條件下會(huì)產(chǎn)生不可逆的分子構(gòu)象變化，因此人類在生物大分子中的分離純化受到限制。

正相色譜法在生物大分子的分離純化中應(yīng)用相對(duì)較少，因?yàn)樗玫娜軇┓浅０嘿F。

11 可逆締合

在一定的溶液條件下，有些酶可以聚合成二聚體、四聚體等，而在另一種條件下，則形成單體。

12 穩(wěn)定性

12.1 熱穩(wěn)定性

大多數(shù)蛋白質(zhì)在加熱至 95°C 時(shí)會(huì)解折疊或沉淀。利用這種特性，在加熱后保留其可溶性活性的蛋白質(zhì)可以很容易地與大多數(shù)其他細(xì)胞蛋白質(zhì)分離。

12.2 蛋白水解的穩(wěn)定性

用蛋白酶處理上清液以消化受污染的蛋白質(zhì)，留下對(duì)蛋白水解具有抗性的蛋白質(zhì)。

13 分配系數(shù)

采用水相兩相萃取分離，常用的生物材料分離系統(tǒng)有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。由于其含水比高，所選用的生物材料分離系統(tǒng)有：聚合物和鹽對(duì)酶無毒。而分離設(shè)備也應(yīng)用于化工行業(yè)，在工業(yè)上受到重視。

開發(fā)：新型雙水相分離技術(shù)有親和雙水相萃取、膜分離雙水相萃取等。

14 表面活性

14.1 泡沫分離

蛋白質(zhì)溶液具有表面活性，溶液中產(chǎn)生氣體，氣泡與液相主體分離并富集在塔頂，達(dá)到分離濃縮的目的。

14.2 反膠束相轉(zhuǎn)移法

反膠束相轉(zhuǎn)移法是80年代出現(xiàn)的一種新型分離技術(shù)。它利用表面活性劑分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的反膠束。在一定條件下，水溶性蛋白質(zhì)分子溶解成反膠束。在極核中，創(chuàng)造條件將蛋白質(zhì)萃取到另一個(gè)水相，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相轉(zhuǎn)移，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

反膠束中的蛋白質(zhì)分子受到周圍水分子和表面活性劑極性頭的保護(hù)，仍然保持一定的活性，甚至表現(xiàn)出超活性。據(jù)報(bào)道，AOT/異辛烷反相膠束用于酵母脂肪酶的相轉(zhuǎn)移。