免疫熒光染色是常用的生化檢查方法，常用于組織學(xué)中抗原或抗體的定位，也可用于體液樣本中抗原或抗體的定量檢測(cè)。很多小伙伴在做免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)時(shí)遇到了各種問(wèn)題。其實(shí)，掌握了免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的原理、操作步驟和注意事項(xiàng)后，順利完成一次免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)并不困難。

1.什么是免疫熒光技術(shù)？
免疫熒光技術(shù)（Immunofluence technology）又稱熒光抗體技術(shù)，主要原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)展示目標(biāo)蛋白。免疫熒光技術(shù)不僅抗原抗體反應(yīng)特異性高，而且在熒光顯微鏡下可以清晰顯示其形態(tài)，直觀性強(qiáng)。

免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)有兩種類型，包括直接免疫熒光和間接免疫熒光。

如何解決免疫熒光染色底色過(guò)重的問(wèn)題？詳細(xì)講解實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

直接免疫熒光是最早的方法。其基本原理是用已知的抗體標(biāo)記熒光素，成為特異性熒光抗體。染色時(shí)，將抗體直接滴在載玻片上孵育，使其直接與載玻片上的抗原結(jié)合，可直接在熒光顯微鏡下檢測(cè)。觀察并做出判斷。

間接免疫熒光法的基本原理是利用特異性抗體與切片中的抗原結(jié)合，然后利用間接熒光抗體與之前的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原抗體熒光復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，通過(guò)復(fù)合物的發(fā)光來(lái)確定檢測(cè)到的抗原。

兩種方法的基本原理是相同的。免疫熒光 (IF) 或細(xì)胞成像技術(shù)使用抗體將熒光染料（也稱為熒光素或熒光團(tuán)）（例如異硫氰酸熒光素 (FITC)）標(biāo)記到特定的目標(biāo)抗原。與熒光素化學(xué)綴合的抗體廣泛用于 IF 實(shí)驗(yàn)。

直接免疫熒光法簡(jiǎn)單、特異、快速、方便，常用于腎活檢組織中多種免疫球蛋白的檢測(cè)和病原體的檢測(cè)。但其缺點(diǎn)是只能檢測(cè)一種相應(yīng)物質(zhì)，靈敏度較差，有時(shí)效果不理想。

間接免疫熒光法由于與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合的熒光素抗體增多，熒光亮度強(qiáng)，因此具有較強(qiáng)的靈敏度。因此，間接免疫熒光法更為常用，只需制備一種熒光抗體，即可應(yīng)用于多種一抗的標(biāo)記展示。

2. 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)的操作步驟
免疫熒光染色的操作步驟通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、重新洗滌和測(cè)定讀數(shù)。本文以間接免疫熒光為例，講解從固定到封固各步驟的原理。

1）樣品制備
對(duì)于貼壁細(xì)胞：可以直接使用多孔板，如6孔板、24孔板等來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，然后在預(yù)定的時(shí)間進(jìn)行固定等后續(xù)操作。也可以使用干凈的蓋玻片，浸泡在70%乙醇中，用無(wú)菌鑷子置于6孔板中，然后用無(wú)菌鹽水、PBS或培養(yǎng)基洗去殘留的乙醇。此時(shí)即可接種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，即可進(jìn)行固定等后續(xù)操作。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：先用固定液固定細(xì)胞，然后將細(xì)胞滴在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)粘在載玻片上。然后就可以進(jìn)行后續(xù)操作了。如果細(xì)胞粘附力較差，可以用PDL等物質(zhì)處理載玻片，以增強(qiáng)載玻片的粘附力。

對(duì)于冷凍切片：將切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。

對(duì)于石蠟切片：將切片在二甲苯中脫蠟 5 分鐘，然后用新鮮二甲苯脫蠟，并用共用二甲苯脫蠟 3 次。無(wú)水乙醇 5 分鐘，兩次。 90%乙醇5分鐘，兩次，70%乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。

抗原修復(fù)：根據(jù)抗原和抗體的不同，可將切片放入以下抗原修復(fù)液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris，pH10.0，95℃加熱12分鐘，約30分鐘慢慢冷卻至室溫。

2）固定
目標(biāo)是保留組織的原始結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞形態(tài)和抗原的細(xì)胞分布。當(dāng)組織細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞會(huì)分解，從溶酶體和其他細(xì)胞器中釋放的酶可以水解組織，這一過(guò)程稱為自溶。為了避免這種情況，有必要固定組織細(xì)胞。

細(xì)胞或切片可以用適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?，固定后用免疫染色洗滌?(P0106) 洗滌兩次，每次 5 分鐘。常用的固定劑有甲醛、戊二醛、甲醇/丙酮。不同固定劑所需的時(shí)間和濃度不同，需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)探索。

3）膜破裂
膜破裂，使抗體有機(jī)會(huì)遇到抗原。因?yàn)槊庖呷旧幕驹硎强乖涂贵w結(jié)合，然后標(biāo)記的抗體發(fā)出熒光，從而可以對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性或定量分析。如果待檢測(cè)的抗原位于細(xì)胞膜或細(xì)胞外基質(zhì)的外表面，則可以省略透化步驟。因?yàn)榭贵w也可以有機(jī)會(huì)與抗原結(jié)合而不破膜。然而，如果要檢測(cè)的抗原位于細(xì)胞內(nèi)，則需要打破細(xì)胞膜，并將細(xì)胞暴露于針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗，以確?？贵w能夠接近表位。常用的破膜劑有Triton X-100、NP-40、Brij-58、皂苷、洋地黃皂苷、甲醇/丙酮。再次，破膜劑的選擇應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

4) 封閉
封閉是最小化一抗非特異性結(jié)合的重要步驟。在使用特異性一抗與目的蛋白結(jié)合的過(guò)程中，如果出現(xiàn)非特異性結(jié)合，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而且背景染色過(guò)強(qiáng)也會(huì)干擾目的染色的呈現(xiàn)，影響對(duì)結(jié)果的判斷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果。理論上，任何不結(jié)合靶抗原的蛋白質(zhì)都可以用于封閉。血清是一種常見(jiàn)的封閉劑，因?yàn)樗信c非特異性位點(diǎn)結(jié)合的抗體。使用血清或蛋白封閉劑進(jìn)行封閉可防止抗體與組織或 Fc 受體的非特異性結(jié)合。

從封閉開(kāi)始的所有步驟，必須注意樣品的保濕，避免樣品干燥，否則容易產(chǎn)生高背景。

5) 一抗孵育
預(yù)選的特異性一抗可以與目的蛋白結(jié)合。這一步需要注意一抗是針對(duì)什么物種的。如果組織細(xì)胞來(lái)源是小鼠，一抗應(yīng)該是某種動(dòng)物抗小鼠，其中某種動(dòng)物是指一抗宿主，例如一抗是山羊抗小鼠，山羊就是一抗抗體宿主。

6）二抗孵育一
抗孵育后，將未結(jié)合的一抗洗掉，即可進(jìn)行一抗與二抗的結(jié)合。二抗應(yīng)該是針對(duì)一抗宿主物種的熒光標(biāo)記二抗。例如，一抗是山羊抗小鼠，二抗應(yīng)該是某種動(dòng)物抗山羊，例如兔抗山羊。

如果進(jìn)行雙染，要注意一抗和二抗宿主的選擇，以免出現(xiàn)交叉結(jié)合的可能。例如，如果組織來(lái)源是小鼠，并且需要檢測(cè)兩種目標(biāo)蛋白，則一抗宿主應(yīng)不同，二抗應(yīng)具有不同的熒光標(biāo)記。針對(duì)目標(biāo)蛋白A的一抗可以是山羊抗小鼠，針對(duì)目標(biāo)蛋白B的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和山羊是不同的一抗宿主），針對(duì)A的二抗是具有綠色熒光的兔抗體山羊二抗、B二抗是兔抗大鼠二抗，有紅色熒光，這種組合是可以的。在熒光顯微鏡下，目標(biāo)蛋白A被染成綠色，目標(biāo)蛋白B被染成紅色。但如果B一抗也是羊抗鼠的話，A二抗也會(huì)和B一抗結(jié)合，這時(shí)候就亂了，熒光鏡下是綠色的。

7）蓋玻片
封片是指免疫染色后使用封片劑將蓋玻片粘附到組織切片或細(xì)胞涂片上。蓋玻片可保護(hù)染色樣本免受物理?yè)p壞。進(jìn)行蓋玻片的封片劑也有助于提高顯微鏡下圖像的清晰度和對(duì)比度。

8) 蛋白質(zhì)的檢測(cè)
對(duì)于免疫熒光染色，此時(shí)已經(jīng)可以直接在熒光顯微鏡下觀察。

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3. 三種細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)舉例
zo-1 的免疫熒光
1) 當(dāng)細(xì)胞在蓋玻片上生長(zhǎng)至95%-100%匯合時(shí)從培養(yǎng)箱中取出。
2) 用預(yù)熱的 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘
3) 4% 甲醛室溫固定 20-30 分鐘
4) 用 1×PBS 洗滌 3 次，每次 10 分鐘
5) 透化0.2% Triton X-100 2-5 分鐘
6) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘
7) 用 5% BSA 室溫封閉 30 分鐘
8) 添加一抗（用 1% BSA 稀釋）放入潮濕盒中，4度過(guò)夜
9) 用1×PBS清洗3次，每次10分鐘
10）加入二抗（1%BSA稀釋）30分鐘，關(guān)燈！ !!
11) 用 1×PBS 清洗 3 次，每次 10 分鐘
12) 用 95% 甘油封片
注：4% 甲醛、0.2% Triton、5% BSA 均用 1×PBS 稀釋"

細(xì)胞載玻片的免疫熒光
1)取出細(xì)胞載玻片放入35mm或60mm用過(guò)的培養(yǎng)皿中，用PBS洗滌3次。
有時(shí)制作的細(xì)胞玻片可能比較小，所以挑取時(shí)要小心，注意反面，放在培養(yǎng)皿中清洗比較方便，避免來(lái)回剪切，清洗時(shí)加PBS，不要洗太多，不要沖洗細(xì)胞。洗的時(shí)候我總是多加一些PBS，稍微搖晃一下就倒掉，不用等5分鐘或者10分鐘。
2) 4%冷多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗滌3次。
3) 用0.2% Triton X-100 透化10 分鐘，用PBS 洗滌3 次。
4)與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗滌3次。
5) 一抗可在濕化盒中4度保存過(guò)夜，或37度保存2小時(shí)。感覺(jué)前者有效。用 PBS 清洗 3 次。
6）二抗室溫放置2小時(shí)（避光），或37度1個(gè)半小時(shí)，PBS洗3次。
7）最好用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，然后直接拍攝熒光膠片。
8) 用蒸餾水洗掉PBS，用甘油封膜，并用指甲油封膜周圍。因?yàn)楦视筒幌駱?shù)脂那樣干燥，如果不用指甲油密封的話就會(huì)亂七八糟。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)
1）將血清蛋白H7.2-7.4在37度PBS中沖洗2小時(shí)。
2) -20度甲醇固定20分鐘后，自然干燥10分鐘
3) PBS清洗：3min*3
4) 1% Triton：25min-30min。配成50ultriton+5ml pBS
5) PBS洗：2*5min
6) 羊血清封閉：37度，20分鐘
7) 一抗，4度過(guò)夜，一般18小時(shí)以上或37度1-2小時(shí)
8) 4度PBS洗，3min*5次
9）二抗37度不到一小時(shí)
10）37度PBS洗，干燥3*5min，密封（封閉液PH8.5）

無(wú)論采用何種方法，用PBS緩沖液漂洗時(shí)，必須漂洗干凈，并測(cè)量pH值?？梢杂肞BS清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間。如果結(jié)果背景較高，可以延長(zhǎng)漂洗次數(shù)。和時(shí)間。

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四、免疫熒光染色注意事項(xiàng)
1）熒光試劑應(yīng)妥善保管

盡管許多熒光團(tuán)相對(duì)光穩(wěn)定，但在儲(chǔ)存和染色過(guò)程中未能避光可能會(huì)導(dǎo)致熒光團(tuán)-抗體綴合物降解，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，熒光物質(zhì)必須在建議的溫度下小心儲(chǔ)存，并始終避光，以保護(hù)其光譜完整性。

2) 仔細(xì)選擇熒光 免疫熒光
技術(shù)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它提供了多重檢測(cè)的機(jī)會(huì)，如今流式細(xì)胞術(shù)可以測(cè)量每個(gè)細(xì)胞 20 多個(gè)離散參數(shù)。在設(shè)計(jì)多重實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)考慮每種熒光團(tuán)的性質(zhì)，例如吸收和發(fā)射最大波長(zhǎng)、消光系數(shù)和斯托克斯位移。

3）適當(dāng)?shù)膶?duì)照是必要的
任何實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析都依賴于相關(guān)的對(duì)照，免疫熒光染色也不例外。每次檢測(cè)需設(shè)置以下三個(gè)對(duì)照：
(1) 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記
(2) 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記
(3) 熒光標(biāo)記對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記

5、免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題排查指南
1）背景染色太強(qiáng)
背景染色太強(qiáng)，意味著除了我們希望看到的特異染色在前景中起主導(dǎo)作用外，還有一幫吃瓜群眾（與我們想要看到的特定染色相同的顏色）在后面。

到底是什么原因?qū)е逻@些演員搶了主角的戲呢？可能的原因如下。

組織切片太厚：這種情況，可以選擇將組織切片變薄。

封閉不良：封閉的目的是減少非特異性結(jié)合，減少背景染色。如果背景太強(qiáng)，考慮更換封閉液或增加封閉孵育時(shí)間

二抗具有非特異性結(jié)合：要驗(yàn)證是否存在這種情況，可以制作空白對(duì)照，只在染色過(guò)程中添加二抗（也就是說(shuō)一抗不要使用特異性一抗）孵育過(guò)程，例如使用一抗稀釋液進(jìn)行孵育一抗的步驟）。如果空白對(duì)照被染色，則表明二抗具有非特異性結(jié)合。此時(shí)，建議更換二抗。

自發(fā)熒光：要了解組織是否具有自發(fā)熒光，請(qǐng)?jiān)诜侨旧珔^(qū)域?qū)ふ覠晒?。一些自發(fā)熒光來(lái)自固定步驟，可以避免戊二醛固定或用 PBS 中的 0.1% 硼氫hua鈉清洗以去除游離醛基。還有一些來(lái)自內(nèi)源性熒光分子的熒光，可以用蘇丹黑/硫酸銅進(jìn)行光漂白。

抗體濃度過(guò)高：降低所用抗體濃度或調(diào)整孵育時(shí)間。

洗滌不充分：染色的步驟較多，而洗滌的步驟也較多。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要確保洗滌到位，不要偷工減料。

2）染色弱或無(wú)染色
可能的原因有：您要研究的目的蛋白在組織本身中不存在或表達(dá)量很小。

如果懷疑目的蛋白不存在，可以通過(guò)WB等多種方法進(jìn)行驗(yàn)證。由于不同蛋白質(zhì)探索實(shí)驗(yàn)的原理和操作不同，結(jié)果可能會(huì)有所不同，多次實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證更容易避免假陰性。如果感興趣的蛋白質(zhì)表達(dá)量較小，則可以考慮采取額外的步驟來(lái)放大熒光信號(hào)。

熒光顯微鏡的問(wèn)題。

如果熒光顯微鏡的參數(shù)設(shè)置不正確，可能看不到熒光。例如，光源/濾光裝置與您想要檢測(cè)的熒光不匹配。每次拍照時(shí)，記得檢查參數(shù)是否正確。

曝光時(shí)間太短或光吸收太低（增益值太低）：您可以嘗試增加增益值和/或增加曝光時(shí)間以找到最佳值。

曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)生熒光猝滅：避免切片過(guò)度曝光。使用后立即將切片存放在黑暗中。

細(xì)胞/組織的過(guò)度固定：因?yàn)檫^(guò)度固定會(huì)使表位被遮蔽，使抗體無(wú)法與抗原結(jié)合，所以當(dāng)然沒(méi)有熒光。所以可以盡量減少固定時(shí)間，也可以嘗試做抗原修復(fù)來(lái)揭示抗原表位。

組織/細(xì)胞干燥：確保切片在整個(gè)染色過(guò)程中保持濕潤(rùn)。

如果細(xì)胞沒(méi)有透化，一抗就無(wú)法進(jìn)入：例如，如果你要研究的目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)，但由于沒(méi)有鉆石，抗體無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞并與目標(biāo)蛋白待在一起，那么你當(dāng)然看不到它們。愛(ài)的火花。所以，我們可以想辦法讓細(xì)胞打開(kāi)綠色通道，架起喜鵲之橋。例如，如果使用甲醛固定組織細(xì)胞，則可以使用 0.2% Triton X-100 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化（濃度可能因?qū)嶒?yàn)而異）。對(duì)于用甲醇或丙酮固定的組織細(xì)胞，不需要 Triton X-100，因?yàn)榍罢呖梢酝富?xì)胞。

一抗用量不足/孵育時(shí)間太短：增加抗體濃度或延長(zhǎng)孵育時(shí)間

一抗不適合：在購(gòu)買一抗之前，記得閱讀產(chǎn)品信息，并不是所有的一抗都可以用于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。另外，請(qǐng)確保產(chǎn)品尚未過(guò)期。

一抗和二抗不兼容：例如，如果您的組織來(lái)源是小鼠，那么一抗應(yīng)該是某種動(dòng)物抗小鼠，例如山羊抗小鼠，那么二抗應(yīng)該是某種動(dòng)物抗體山羊，如兔抗羊。也就是說(shuō)，二抗應(yīng)該針對(duì)一抗宿主。

切片保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：樣本染色后應(yīng)盡快觀察拍照，否則信號(hào)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減弱。考慮將切片盡可能長(zhǎng)時(shí)間地保存在 4?C 避光條件下。

抗體儲(chǔ)存問(wèn)題：避免反復(fù)冷凍和解凍抗體，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致抗體降解。建議購(gòu)買抗體后，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的需要，將抗體分成幾小份保存，以便每次使用一小管。另外，存放前記得閱讀使用說(shuō)明書(shū)，并按照使用說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明進(jìn)行存放。比如具體的儲(chǔ)存溫度、是否避光等。