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lumafuor高效retrobeads操作說(shuō)明

更新時(shí)間:2023-12-11      點(diǎn)擊次數(shù):1020
一、包裝及稀釋?zhuān)?/span> 
Lumafuor 的珠子裝在密封小瓶中,并將濃縮的珠子懸浮在蒸餾水中。如果使用紅色微珠作為神經(jīng)通路的逆向示蹤,推薦稀釋方法:大鼠視覺(jué)皮層可采用1:4稀釋?zhuān)也粫?huì)降低微珠熒光標(biāo)記的強(qiáng)度和質(zhì)量。但對(duì)于第一次實(shí)驗(yàn),我們不建議使用稀釋的微珠,而是使用原液進(jìn)行進(jìn)樣示蹤。除蒸餾水外,也可使用常規(guī)鹽溶液如 NaCl 和 KCl 作為稀釋劑。如果使用綠色珠子,強(qiáng)烈建議使用原液而不需稀釋。 
二、儲(chǔ)存:
為了避免蒸發(fā),珠溶液應(yīng)保存在4度冰箱中。不要冷凍它!冷凍的豆子將毫無(wú)用處,無(wú)法使用。干燥后的珠子也不能使用(不能重新懸浮),產(chǎn)品沒(méi)有明顯的使用壽命。如果按要求保存,可保存數(shù)年。 
三、注射: 
珠子最好使用壓力注射,如1ml Hamilton 微量注射器或氣動(dòng)注射系統(tǒng)。如需小面積顯微注射(30-50nl),可采用末端直徑為30-50um的玻璃電極進(jìn)行注射,而較大直徑的玻璃電極可用于常規(guī)反向示蹤(注射量0.1-0.3ul)。然而,即使劑量較高,珠子也不會(huì)從注射部位顯著擴(kuò)散(通常小于 1 毫米)。因此,為了盡可能完整地標(biāo)記投射到更大核的神經(jīng)元,需要多點(diǎn)注射。盡管珠子帶負(fù)電,但不建議將離子滲透法用于示蹤珠子。 
4、生存時(shí)間:
在大多數(shù)恒溫脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中,檢測(cè)珠子的最短有效時(shí)間是24小時(shí)。 48小時(shí)內(nèi),標(biāo)記強(qiáng)度隨進(jìn)樣時(shí)間增加而增加,48小時(shí)后熒光強(qiáng)度保持恒定。對(duì)于冷血?jiǎng)游?,建議檢測(cè)珠子的時(shí)間為 1 周。目前尚未檢測(cè)出珠子的最長(zhǎng)可檢測(cè)周期。然而,珠子的熒光強(qiáng)度和質(zhì)量可以在體內(nèi)至少14個(gè)月保持不變,并且細(xì)胞可能被長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記。尚未發(fā)現(xiàn)珠子對(duì)動(dòng)物或神經(jīng)元有毒性作用。
五、固定及處理:
標(biāo)準(zhǔn)固定方法是:0.1mpbs洗滌或灌注并固定在4%多聚甲醛中(0.1mpbs制劑,pH7.4)。用戊二醛固定會(huì)產(chǎn)生大量的組織自發(fā)熒光,這會(huì)阻礙珠子標(biāo)記的神經(jīng)元。而且戊二醛固定的組織中不會(huì)全觀(guān)察到綠色珠子,因此應(yīng)盡量避免。如果使用冷凍切片,則應(yīng)使用 PBS 沖洗切片并用明膠包被的載玻片干燥。風(fēng)干后,載玻片應(yīng)用二甲苯放置 1 分鐘透明,然后用熒光封片或 krystalon 密封。 Fluoromount可以從atomrgic chemetals Corp. (Farmingdale, NY)購(gòu)買(mǎi);克里斯塔隆可以從
Harleco(EM Industries,新澤西州吉布斯敦)。切片只能短時(shí)間接觸乙醇或二甲苯,但長(zhǎng)期接觸(超過(guò) 5 分鐘)會(huì)損壞珠子。微珠對(duì)甘油非常敏感,在甘油環(huán)境中熒光會(huì)很快被提取。因此,不宜使用甘油封孔劑。如果無(wú)法避免,可用水楊酸甲酯代替甘油作為封閉劑。如果將切片保存在黑暗環(huán)境中,熒光珠標(biāo)記的細(xì)胞一年內(nèi)無(wú)法提?。ǖ衅臒晒獗尘皶?huì)增加)。到目前為止,還沒(méi)有珠子標(biāo)記的組織涂有塑料材料的記錄。
觀(guān)察:
紅珠中的染料是羅丹明,所以所有與羅丹明配套的熒光濾光片都可以使用。尼康公司一些舊的羅丹明濾光片由于背景較高,可能無(wú)法觀(guān)察到熒光珠。一般情況下,蔡司、徠茲的標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片可以獲得較好的觀(guān)察效果。大多數(shù)綠色熒光濾光片都可以很好地觀(guān)察綠豆的熒光結(jié)果。設(shè)置為熒光黃的濾光片可以獲得強(qiáng)烈明亮的熒光,但也帶來(lái)較高的背景干擾。結(jié)果表明,較寬波段的熒光濾光片比窄帶濾光片可以獲得更強(qiáng)的熒光信號(hào)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的觀(guān)察和拍照,珠子的熒光沒(méi)有出現(xiàn)。


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