乙醛脫氫酶（ALDH）測試盒

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

乙醛脫氫酶 (EC 1.2.1.10)是醛脫氫酶的一種，廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)。主要作用是將乙醛氧化成乙酸，在酒精代謝中起主要作用。在人類和許多動物體內(nèi)，線粒體乙醛脫氫酶能把對生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化，所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注；同時，乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面有較廣泛的研究應(yīng)用。

測定原理

在輔酶Ⅰ存在的條件下，乙醛脫氫酶催化乙醛和NAD+轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，在340nm處的吸光值會增加，測定340nm處的吸光值變化，可計算得到乙醛脫氫酶的活性。

自備實驗用品及儀器

天平、離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水。

試劑組成和配制

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體1mL×1支，4℃避光保存。

試劑四：液體1mL×1支，4℃保存。

試劑五：液體1mL×1支，4℃保存。

ALDH提取

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心20min。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 液體：直接檢測。

測定操作表

1. 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至340nm。

2. 操作表

ALDH酶活計算

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T = 804×△A÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 804×△A÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每104個細(xì)胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T= 804×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 804×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b．用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mg prot）= ×V反總÷（V樣×Crp）÷T = 1608×△A÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T = 1608×△A÷W

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每104個細(xì)胞每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/104cell）= ×V反總÷（V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬個））÷T= 1608×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmol NAD+的酶量為1個酶活單位。

ALDH酶活（nmol/min/mL）= ×V反總÷V樣÷T= 1608×△A

：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3 L/µmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

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