jenabioscience:高保真熒光素PCR標(biāo)記試劑盒——PCR法制備熒光素標(biāo)記的DNA探針

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學(xué)家于1998年成立，利用超過25年的學(xué)術(shù)知識(shí)為100多個(gè)國(guó)家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實(shí)驗(yàn)室使用。

運(yùn)輸:凝膠包裝運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件:儲(chǔ)存在-20°C
避免冷凍/解凍循環(huán)，避光儲(chǔ)存

保質(zhì)期:12個(gè)月

光譜特性: λexc492納米，λ全身長(zhǎng)的517納米，ε 83.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)

描述:
高保真熒光素PCR標(biāo)記試劑盒設(shè)計(jì)用于通過PCR隨機(jī)產(chǎn)生熒光素修飾的DNA探針。這種探針非常適合熒光原地的雜交(FISH)和Northern印跡實(shí)驗(yàn)。如果模板量有限或需要擴(kuò)增特定的DNA片段，基于PCR的標(biāo)記優(yōu)于用Klenow片段的隨機(jī)引物標(biāo)記。高達(dá)4kb的探針擴(kuò)增是可行的。

使用優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液和高保真聚合酶混合物，熒光素-12-dUTP作為其天然對(duì)應(yīng)物dTTP的替代物被有效地?fù)饺氲紻NA中，所述高保真聚合酶混合物包括Taq聚合酶和校對(duì)酶。50 %熒光素-12-dUTP取代通常導(dǎo)致反應(yīng)和標(biāo)記效率之間的最佳平衡。然而，熒光素-12-dUTP/dTTP比率的個(gè)體優(yōu)化可以容易地用單核苷酸形式實(shí)現(xiàn)。

該試劑盒包含足夠的試劑，可用于10次標(biāo)記反應(yīng)(S-Pack)或50次標(biāo)記反應(yīng)(L-Pack)，每次20μL(50%熒光素-12-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米熒光素-12-dUTP)。

內(nèi)容:
高保真聚合酶
在含有50%甘油(v/v)的儲(chǔ)存緩沖液中
# APP-101-FAMX-S:1個(gè)40微升(100個(gè)單位，2.5個(gè)單位/微升)
# APP-101-FAMX-L:2個(gè)40微升(2個(gè)100單位，2.5單位/微升)

高保真標(biāo)記緩沖液
1個(gè)500微升(10倍)

dATP溶液
1個(gè)20微升(100毫米)

dGTP解決方案
1個(gè)20微升(100毫米)

dCTP溶液
1個(gè)20微升(100毫米)

dTTP溶液
1個(gè)20微升(100毫米)

熒光素-12-dUTP
# APP-101-FAMX-S:1個(gè)10微升(1毫米)
# APP-101-FAMX-L:5個(gè)10微升(1毫米)

DNA
1個(gè)20微升(100納克/微升)

500 bp正向引物
1個(gè)20微升(10微米)

500 bp反向引物
1個(gè)20微升(10微米)

PCR級(jí)水
1x 1.2毫升

由用戶提供
DNA模板
底漆
DNA純化工具(可選)

1.工作溶液的制備

1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制備

• 將100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解凍，并短暫旋轉(zhuǎn)。
• 用PCR級(jí)水制備1:100的稀釋液，以達(dá)到1 mM的最終濃度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR級(jí)水)。
• 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可儲(chǔ)存在-20°c下。準(zhǔn)備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。

1.2 1mM dTTP工作溶液的制備

• 在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暫旋轉(zhuǎn)。
• 用PCR級(jí)水制備1:100的稀釋液，以達(dá)到1 mM的最終濃度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR級(jí)水)。
• 1 mM dTTP工作液可儲(chǔ)存在-20°c下。準(zhǔn)備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。

3.標(biāo)準(zhǔn)PCR標(biāo)記方案

標(biāo)準(zhǔn)方案用于標(biāo)記500 bp的DNA片段。反應(yīng)和標(biāo)記效率之間的最佳平衡通常是按照下面的標(biāo)準(zhǔn)方案用50%熒光素-12-dUTP取代來實(shí)現(xiàn)的，然而，個(gè)體優(yōu)化可能改善個(gè)體應(yīng)用的結(jié)果。

• 按照下列順序在冰上組裝PCR(無脫氧核糖核酸酶反應(yīng)管)。
• Voretex和簡(jiǎn)單的降速。
• 在弱光條件下進(jìn)行檢測(cè)設(shè)置和反應(yīng)。

推薦的騎行條件

1)退火溫度取決于所用引物的熔化溫度。
2)延伸時(shí)間取決于待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度。建議時(shí)間為2分鐘/kbp。72°C時(shí)的伸長(zhǎng)率也同樣有效。

為了獲得最佳擴(kuò)增結(jié)果和高摻入率，對(duì)于每個(gè)新的引物-模板對(duì)，可能需要對(duì)推薦的PCR檢測(cè)和循環(huán)條件進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化。

4.探針純化:

大多數(shù)雜交實(shí)驗(yàn)不需要探針純化。如果下游應(yīng)用需要純化(例如通過吸光度測(cè)量進(jìn)行濃度測(cè)定)，我們建議采用基于硅膠膜或凝膠過濾的純化方法。

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上海牧榮生物科技有限公司

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